摘要: 用核酸分子杂交技术检测细菌的遗传同源性，是现代细菌分类和鉴定工作中的一项可靠指标。然而，目前所用的滤膜杂交方法需要同位素标记，一般实验室难以推广，影响了该项技术在基层实验室的使用.我们对照文献⁽¹⁾，利用国产分光光度计和G+Cmol%加热装置检测部分肠杆玄科钾菌的DNA；DNA遗传同源性，实验结果证明，此方法方便、准确，为细菌的分类、鉴定提供了可靠的依据。1材料和方法1.1仪器及试剂753WB₁型可见紫外分光光度计：上海光学仪器厂产；细菌DNAG+Cmol%加热装置：浙江永加华阳工程仪器厂产，DF-6p3c超声破碎仪：宁波经济技术开发区科生仪器厂产；所用试剂见文献⁽²⁾。1.2实验菌种及培养实验菌株见附表，除枯草芽胞杆菌AS·；188购自上海复旦大学，其余均购自卫生部药品生物制品检定所.菌株均用普通营养琼脂37℃过夜培养，收获湿菌4~6g供用。1.3DNA提取及处理参照文献⁽²⁾，用氯仿一水饱和酚联合提取法.湿菌用生理盐水洗2次，SE洗2次.悬浮于50mlSE中。以每毫升50g溶菌酶和2.5%SDS联合破壁，氯仿一水饱和酚反复提取4次，单独氯仿提取。2次，RNA酶消化残留RNA。2倍量冷乙醇沉淀，搅出DNA丝，溶于10ml0.1SSC中。待测DNA在波长260nm，230nm、280nm的吸光度之比为1：0.450：0.515为纯度合格.用0.1SSC把DNA准确配成80μg/ml浓度(260nm吸光度为1.5)，冰浴中50W超声破碎1min。1.4检测DNA复性数率，取样品A，B，M(为A，B各1ml)2ml，加IOSSC0.48m1.使其浓度为2SSC。100℃水浴10min后立即加入预热的比色杯中，置加热的比色架上，塞上热敏电阻探头，停止加热，观察温度。待样品温度降至最适复性温度(TOR)，记录吸光度值(A_a)，每5min1次，观察30min(A₃₀)将得到一条随时间延长，吸光度逐步下降的直线。以A₀-A₃₀/30min将得到A、B、M3样品的复性数率V_A、V_B、V_m。根据公式：D%=4V_m-（V_A+V_B)/2√V_A*V_B计算A、B样品DNA同源性。1.5杂交特异性检查，用温度裂解法分别检测天然DNA和M样品的T_m值，两者相近证明DNA单链在复性过程中形成的碱基对是特异的。