Simultaneous determination of antibiotics in tap water with automatic solid phase extraction-UHPLC-MS/MS
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摘要:目的 建立一种同时检测自来水中四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、酚类和磺胺类27种抗生素残留的全自动固相萃取 – 超高效液相色谱 – 串联质谱分析方法。方法 采集200 mL自来水样本在24 h内加入内标混合溶液，经玻璃纤维滤纸过滤后，调节pH到7.5～8.5；在全自动固相萃取仪上使用固相萃取柱完成样本富集，用甲醇溶液洗脱后氮吹至干，20 %甲醇水溶液复容，经T3色谱柱在40 %乙腈甲醇 – 0.2 %甲酸水溶液的流动相下梯度分离，高效液相色谱串联质谱检测，内标法定量分析；并采用该方法对浙江省某农村地区的70份自来水样本进行检测。结果 实验结果显示，27种抗生素在1～100 ng/mL范围内线性关系良好，r值为0.9963～1.0000；该方法检出限（MDL）为0.004～0.296 ng/L，方法定量限（MQL）为0.013～0.988 ng/L，平均回收率为70.0 %～120.8 %；通过对浙江省某农村70份自来水样本进行检测，检测到4种抗生素残留，皆为大环内酯类抗生素，分别为罗红霉素[（0.162～2.858）ng/L]、克拉霉素[（0.063～0.849）ng/L]、红霉素[（0.100～1.804）ng/L]和替米考星[（0.167～1.418）ng/L]，其余23种抗生素均未检出。结论 本研究建立的全自动固相萃取 – 超高效液相色谱 – 串联质谱法操作简单、省时省力、灵敏度高、准确可靠，可适用于自来水中27种抗生素残留的快速检测。
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关键词:
- 超高效液相色谱 – 串联质谱法 /
- 全自动固相萃取 /
- 抗生素 /
- 自来水
Abstract:Objective To establish a rapid method for simultaneous determination of 27 antibiotics in tap water with ultra high performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) combined with automatic solid phase extraction.Methods After added internal standard solutions of 27 antibiotics within 24 hours, the tap water sample (200 mL) was filtered with glass fiber filters and adjusted for pH value of 7.5 – 8.5. The reference antibiotics in the tap water samples were concentrated with extraction column in the automated solid phase extraction instrument and then eluted with methanol solution. The reference antibiotics in the eluate was reconstituted into constant solution with 20% methanol and separated gradiently with T3 chromatography column using 40% acetonitrile methanol and 0.2% formic acid solution as mobile phase; and finally detected with UHPLC-MS/MS and quantified with internal standard method. Thereafter, 70 tap water samples were collected in rural areas of Zhejiang province and 27 antibiotics in the samples were detected simultaneously using the established method.Results A good linearity was observed for detections of the 27 antibiotics at the concentration of 1 to 100 ng/mL, with the correlation coefficient ranging from 0.9963 to 1.0000. For the established method, the detection limits were between 0.004 – 0.296 ng/L; the quantification limits were from 0.013 to 0.998 ng/L; and the mean recoveries ranged from 70.0% – 120.8%. For the 70 rural tap water samples, only four macrolide antibiotics were detected, including roxithromycin, clarithromycin, erythromycin, and tilmicosin, with the concentration ranges (ng/L) of 0.162 – 2.858, 0.063 – 0.849, 0.100 – 1.804, and 0.100 – 1.804, respectively．Conclusion The established method is simple to operate, time- and labor-saving; the method is also of high sensitivity, accuracy and reliability; and the method could be applied to rapid determination of 27 antibiotics in tap water．-
Keywords:
- UHPLC-MS/MS /
- automatic solid phase extraction /
- antibiotics /
- tap water
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抗生素作为一种新兴污染物，其使用情况及环境污染问题正逐步受到国内外关注[1-6]。水环境中的抗生素含量通常是痕量的，不易引起急性变化，但是人类的持续排放会使其蓄积放大，最终危害人类健康[1,4]。有研究表明，抗生素可干扰肠道菌群平衡，长期低剂量抗生素与儿童肥胖等健康问题相关[7-8]。水环境中残留的抗生素种类较多，包括磺胺类、大环内酯类、氟喹诺酮类、四环素类、β – 内酰胺类和酚类等，因此建立一套常用抗生素的高灵敏度快捷检测方法十分重要。关于水中抗生素检测方法的研究中，最早的分析仪器是液相色谱，但其灵敏度低，受干扰程度大，近年来逐步被超高效液相色谱 – 串联质谱法所取代，因其灵敏度和特异度高及分离组分时间短等优点表现出了巨大的潜力[9]。但目前自来水样本的前处理多为大体积上样，人力及时间成本较高，因此本研究优化样本前处理条件，使用全自动固相萃取装置，通过优化质谱参数、色谱条件及前处理方法，采用同位素内标法建立了全自动固相萃取 – 超高效液相色谱 – 串联质谱法同时检测自来水中四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类、酚类和磺胺类共27种抗生素残留的检测方法，并对浙江地区某农村中70份自来水样本进行测定分析，为生活用水中抗生素的监测提供科学依据。现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
1.1.1 仪器和材料
Acquity TMUltra Performance LC超高效液相色谱仪（美国Waters公司），QTRAP 6500+配质谱联用仪（美国AB SCIEX公司），SPE1000全自动固相萃取仪（北京莱伯泰科仪器有限公司），MV5氮吹仪（北京莱伯泰科仪器有限公司），Milli-pore超纯水仪器（美国Milli-Q公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（3cc，60 mg，美国Waters公司），0.7 μm玻璃纤维过滤膜（美国Whatman公司），ACQUITY UPLC T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司）。
1.1.2 主要试剂
抗生素标准品：（1）氟喹诺酮类：环丙沙星（ciprofloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、诺氟沙星（norfloxacin）、培氟沙星（pefloxacin）、恩诺沙星（enrofloxacin）、达氟沙星（danofloxacin）、双氟沙星（difloxacin）、洛美沙星（lomefloxacin）；（2）酚类：氟苯尼考（florfenicol）、氯霉素（chloramphenicol）、甲砜霉素（thiamphenicol）；（3）四环素类：强力霉素（doxycycline）、四环素（tetracycline）、金霉素（chlortetracycline）、土霉素（oxytetracycline）；（4）大环内酯类：阿奇霉素（azithromycin）、罗红霉素（roxithromycin）、克拉霉素（clarithromycin）、脱水红霉素（erythromycin-H2O）、替米考星（tilmicosin）、螺旋霉素（spiramycin）；（5）磺胺类：甲氧苄氨嘧啶（Trimethoprim）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine）、磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）、乙酰化磺胺甲嘧啶（Acetylated sulfamethazine）、乙酰化磺胺甲恶唑（acetylated sulfamethoxazole）。内标标准品：阿奇霉素 – D3（azithromycin-D3）、磺胺甲恶唑 – D4（sulfamethoxazole-D4）、氯霉素 – D5（chloramphenicol-D5）、四环素 – D6（tetracycline-D6）、罗红霉素 – D7（roxithromycin-D7）、环丙沙星 – D8（cirpofloxacin-D8）。27种标准品和6种内标物质均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司。甲醇（色谱纯，美国Supelco公司），乙腈（色谱纯，美国Supelco公司），甲酸（色谱纯，美国Aladdin公司）。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液的配置
储备溶液：分别准确称取27种抗生素标准品及6种内标标准品各10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，贮存于 – 20 ℃以下冰箱中。混合标准储备溶液：取上述27种标准储备溶液，用甲醇稀释，配成浓度为1000 ng/mL的混合标准储备溶液。混合内标储备溶液：取上述6种内标溶液，用甲醇稀释，配成浓度为1000 ng/mL的混合内标储备溶液。标准工作溶液：根据需要吸取上述混合标准储备溶液和内标储备溶液，用 20 %甲醇的水溶液稀释，配成混合标准工作液。
1.2.2 样品前处理方法
准确量取200 mL自来水样本，分别加入100 µg/L的内标溶液50 μL，充分混匀，使用0.7 μm的玻璃纤维过滤膜过滤后，调节pH为7.5～8.5。使用全自动固相萃取仪进行样本富集和净化，程序设置如下：活化：2 mL甲醇和2 mL高纯水；上样：200 mL水样，5 mL/min速度流下；淋洗：2 mL高纯水；氮气干燥30 min；洗脱：4 mL甲醇。洗脱液在40 ℃下氮吹至干，加入0.5 mL的20 %甲醇水溶液复容，涡旋振荡后转移至进样小瓶中。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；柱温35℃；流速0.35 mL/min；进样量：10 μL。流动相A：40 %甲醇乙腈溶液，流动相B：0.2 %甲酸水溶液。梯度为0～1.0 min，90 % B；1.0～7.0 min，2 % B；7.0～9.5 min，2 % B；9.5～9.8 min，90 % B；9.8～11.5 min，90 %B。
1.2.3.2 质谱条件（表1）
表 1 27种抗生素药物及其6种内标物质的质谱参数化合物名称 保留时间（min） 母离子 定量子离子 定性子离子 去簇电压（V） 碰撞电压（定量/定性，V） 环丙沙星 4.97 332.1 288.1 245.1 80 25/33 氧氟沙星 4.89 362.2 318.1 261.1 80 26/38 诺氟沙星 4.91 320.1 276.1 233.1 80 26/35 培氟沙星 4.95 334.1 316.1 290.2 80 27/25 恩诺沙星 5.10 360.1 316.1 245.1 80 28/36 达氟沙星 5.04 358.1 340.1 314.1 77 30/24 双氟沙星 5.35 400.1 356.1 299.1 80 28/41 洛美沙星 5.07 352.0 265.0 308.1 80 33/28 氟苯尼考 6.11 356.0 219.2 119.0 – 70 – 16/– 23 氯霉素 6.41 321.0 152.1 256.9 – 75 – 24/– 17 甲砜霉素 5.31 353.9 289.9 184.9 – 75 – 18/– 28 强力霉素 5.87 445.0 428.1 154.1 80 24/38 四环素 5.09 445.1 410.2 427.1 80 24/29 金霉素 5.66 479.1 462.0 444.0 80 24/28 土霉素 4.90 461.2 426.2 443.2 80 25/17 阿奇霉素 5.32 749.6 591.5 158.0 100 29/34 罗红霉素 6.85 837.6 679.5 158.1 50 30/37 克拉霉素 6.82 748.6 590.4 158.0 100 27/33 脱水红霉素 6.31 734.5 576.4 158.0 30 26/36 替米考星 5.63 869.5 696.5 174.2 100 52/52 螺旋霉素 5.22 843.5 142.1 174.2 60 45/50 甲氧苄氨嘧啶 4.75 291.1 230.1 123.1 95 33/34 磺胺嘧啶 4.64 251.1 156.0 92.0 40 22/38 磺胺甲恶唑 6.03 254.1 156.0 108.0 65 22/36 磺胺二甲嘧啶 5.36 279.1 186.1 156.0 60 23/27 乙酰化磺胺甲嘧啶 5.39 321.1 134.0 186.0 50 35/25 乙酰化磺胺甲恶唑 6.20 296.0 198.0 134.0 70 24/32 阿奇霉素 – D3 5.30 752.4 594.5 158.0 100 38/44 磺胺甲恶唑 – D4 6.01 258.1 160.0 112.0 65 22/36 氯霉素 – D5 6.39 326.0 157.0 262.0 – 75 – 23/– 16 四环素 – D6 5.08 451.2 416.2 433.3 80 26/18 罗红霉素 – D7 6.83 844.5 686.4 158.2 50 30/37 环丙沙星 – D8 4.95 340.0 296.0 249.0 80 24/33 电喷雾正离子源和电喷雾负离子源；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）扫描模式；喷撞气 medium ；气帘气30 psi ；喷雾气55 psi ；辅助加热气55 psi；温度400 ℃ ；离子源电压 4500 V。各化合物的质谱参数见表1。
1.3 方法验证
以抗生素同位素化合物为定量内标制作内标法校准曲线（1、2、5、10、20、50、100 ng/mL），通过逐级稀释标准溶液的方法，当色谱峰信噪比分别不低于3和10时确定为仪器检出限和仪器定量限。选择5、50和100 ng/mL 3个标准点分别在24 h内连续进样6次且重复操作3 d的情况下验证日内精密度（24 h）和日间精密度（72 h）及其相对标准偏差。取6个自来水样本分别在10、100和250 ng/L 3个加标水平进行加标回收试验，平行测定6次，计算每种目标抗生素的中、低、高和平均加标回收率。根据仪器检出限（instrument detection limit，IDL）和定量限（instrument quantification limit，IQL）参数，结合浓缩倍数和加标回收率计算每种目标抗生素的方法检出限（method detection limit，MDL）和方法定量限（method quantification limit，MQL）[10]。
1.4 实际样本分析
于2020年8月采集浙江省某农村地区的70份居民家中自来水样本，同时收集7份全程空白样本进行质量控制。在样本采集时水样注满采样瓶并于4 ℃避光保存，冷链运输至当地疾病预防控制中心理化检验科实验室，并在24 h内加入内标混合溶液。水样本采用建立的优化方案进行分析，经预处理后，使用超高效液相色谱串联质谱仪器进行27种目标抗生素的检测。
2. 结 果
2.1 色谱条件的选择
以T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）作为分析柱，分别使用流动相40 %甲醇乙腈 – 0.1 %甲酸水溶液、40 %甲醇乙腈 – 0.2 %甲酸水溶液、40 %乙腈甲醇 – 0.2 %甲酸水溶液进行优化，结果显示，使用40 %甲醇乙腈 – 0.1 %甲酸水溶液和40 %乙腈甲醇 – 0.2 %甲酸水溶液均能得到较好的物质分离。而略高的甲酸浓度可以使保留的目标物质得到更高更窄的峰型，因此根据峰型最终选择流动相A为40 %甲醇乙腈溶液，流动相B为0.2 %甲酸水溶液。
2.2 质谱条件的选择
用20 ng/mL的标准液注入离子源，分别在正离子和负离子模式下离子全扫描，并进行质谱参数优化。氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素 – D5在电喷雾负离子源模式下具有较高的响应值；其余化合物均在电喷雾正离子源模式下有较高的响应值。通过对各化合物进行子离子扫描，选择响应相对较高的离子对，在 MRM 模式下优化其碰撞能量，进而对温度、气帘气压力、辅助加热气压力进行了优化，完成质谱条件的建立。
2.3 固相萃取柱和上样体积的优化
比较CNW HLB（6cc 500 mg）和Waters HLB（3 cc 60 mg）2种固相萃取柱分别对浓度为100 ng/L的100、200、250、500 mL纯水的检测分析结果显示，使用CNW HLB（6 cc 500 mg）固相萃取柱处理的加标回收率分别为31.1 %～77.2 %、57.7 %～123.2 %、56.3 %～131.7 %、66.9 %～125.9 %，使用Waters HLB（3 cc 60 mg）固相萃取柱处理的加标回收率分别为27.1 %～83.2 %、68.3 %～117.9 %、68.2 %～125.7 %、62.8 %～128.1 %，CNW HLB（6 cc 500 mg）对500 mL的水样萃取和Waters HLB（3 cc 60 mg）对200 mL水样萃取的回收率结果较好且结果相近。考虑到水样的体积决定前处理时间，故选择使用Waters HLB（3 cc 60 mg）对200 mL体积水样进行前处理。
2.4 复容溶剂和体积的优化
在氮吹至干的条件下，分别以0.5和1 mL体积的50 %甲醇水以及0.5和1 mL体积的20 %甲醇水对残留物质进行复容定容，大部分抗生素在20 %甲醇水的定容条件下峰型较好。复容体积为1 mL 20 %的加标回收率为56.7 %～123.3 %，在0.5 mL 20 %甲醇条件下复容加标回收率结果显示较好为67.7 %～113.1 %，因此氮吹至干后选择体积为0.5 mL的20 %甲醇水进行的复容。
2.5 方法验证
2.5.1 标准曲线的线性及精密度（表2）
表 2 27种抗生素药物的线性参数及仪器性能参数类别 名称 线性方程 r 值 IDL（µg/L） IQL（µg/L） 日内精密度（%） 日间精密度（%） 氟喹诺酮类 环丙沙星 y = 1.99762x + 0.00030 0.9994 0.0344 0.1147 1.36 1.64 氧氟沙星 y = 11.55295x – 0.01254 0.9997 0.0057 0.0191 1.43 1.83 诺氟沙星 y = 1.71629x + 0.00866 0.9993 0.0364 0.1213 1.98 1.79 培氟沙星 y = 9.11526x – 0.05177 0.9994 0.0417 0.1392 1.75 3.60 恩诺沙星 y = 7.11977x + 0.04373 0.9991 0.0074 0.0246 1.65 1.79 达氟沙星 y = 15.90120x – 0.12187 0.9995 0.0196 0.0652 1.84 2.81 双氟沙星 y = 6.39833x – 0.01570 0.9997 0.0178 0.0592 2.64 3.69 洛美沙星 y = 6.64743x + 0.03654 0.9992 0.0095 0.0318 2.36 2.67 酚类 氯霉素 y = 1.17566x + 0.00355 1.0000 0.0141 0.0470 3.53 3.21 甲砜霉素 y = 0.61883x + 0.01184 0.9991 0.0256 0.0854 2.96 3.14 氟苯尼考 y = 0.16734x + 0.00389 0.9993 0.0341 0.1137 3.16 3.65 四环素类 四环素 y = 0.84604x + 0.00306 0.9992 0.0587 0.1958 1.28 1.35 土霉素 y = 0.98315x – 0.00257 0.9997 0.0640 0.2134 1.02 3.04 金霉素 y = 0.33857x + 0.00400 0.9973 0.0830 0.2767 1.29 1.76 强力霉素 y = 1.57520x + 0.00748 0.9995 0.0378 0.1259 1.54 1.72 大环内酯类 阿奇霉素 y = 0.48366x + 0.00832 1.0000 0.0294 0.0979 1.57 1.99 罗红霉素 y = 1.39340x + 0.02052 0.9995 0.0037 0.0124 2.30 1.89 克拉霉素 y = 1.31656x + 0.02119 0.9996 0.0026 0.0085 3.06 2.46 红霉素 y = 1.59802x + 0.03415 0.9990 0.0058 0.0192 1.65 2.16 替米考星 y = 0.51372x + 0.00475 0.9995 0.0114 0.0380 3.13 2.93 螺旋霉素 y = 0.01871x + 0.00008 0.9993 0.0829 0.2763 3.95 6.63 磺胺类 甲氧苄氨嘧啶 y = 5.58975x + 0.12082 0.9963 0.0015 0.0049 3.44 2.98 磺胺嘧啶 y = 1.56764x + 0.01207 0.9998 0.0042 0.0140 2.34 2.08 磺胺甲恶唑 y = 1.35660x + 0.00257 1.0000 0.0125 0.0415 1.98 2.00 磺胺二甲嘧啶 y = 3.23837x + 0.04558 0.9993 0.0032 0.0108 3.03 3.53 乙酰化磺胺甲恶唑 y = 0.72177x – 0.00201 0.9999 0.0283 0.0943 2.88 2.39 乙酰化磺胺甲嘧啶 y = 0.77589x – 0.00262 0.9999 0.0095 0.0315 3.26 2.95 以抗生素同位素化合物为定量内标制作内标法校准曲线（1、2、5、10、20、50、100 ng/mL），27种目标抗生素的线性良好。通过逐级稀释标准溶液的方法，当色谱峰信噪比分别不低于3和10时确定为仪器检出限和仪器定量限。选择5、50和100 ng/mL 3个标准点分别在1 d内连续进样6次且连续重复操作3 d的情况下验证日内精密度和日间精密度，相对标准偏差分别为1.02 %～3.53 %和1.35 %～6.63 %。
2.5.2 方法回收率及MDL和MQL（表3）
表 3 方法回收率及MDL和MQL类别 化合物 加标回收率（%） MDL（ng/L） MQL（ng/L） 低浓度 中浓度 高浓度 平均值 氟喹诺酮类 环丙沙星 88.7 88.5 103.1 93.4 0.092 0.307 氧氟沙星 73.5 72.8 73.5 73.3 0.020 0.065 诺氟沙星 103.8 96.9 111.1 103.9 0.088 0.292 培氟沙星 87.0 96.2 97.4 93.5 0.112 0.372 恩诺沙星 86.1 104.9 108.3 99.8 0.019 0.062 达氟沙星 85.8 90.5 90.9 89.1 0.055 0.183 双氟沙星 83.6 96.3 99.5 93.1 0.048 0.159 洛美沙星 111.8 105.5 106.6 108.0 0.022 0.074 酚类 氯霉素 101.1 89.5 87.6 92.7 0.038 0.127 甲砜霉素 117.0 107.3 126.3 116.9 0.055 0.183 氟苯尼考 118.2 101.8 101.8 107.2 0.080 0.265 四环素类 四环素 77.6 84.9 88.8 83.8 0.175 0.584 土霉素 93.6 114.3 135.8 114.6 0.140 0.465 金霉素 89.6 65.2 55.2 70.0 0.296 0.988 强力霉素 84.9 63.2 64.8 70.9 0.133 0.444 大环内酯类 阿奇霉素 87.3 95.0 109.9 97.4 0.075 0.251 罗红霉素 86.3 102.1 107.7 98.7 0.009 0.031 克拉霉素 115.0 129.1 103.9 116.0 0.006 0.018 红霉素-水 79.6 101.1 115.9 98.9 0.015 0.049 替米考星 73.8 97.1 98.0 89.6 0.032 0.106 螺旋霉素 101.6 65.2 64.4 77.1 0.269 0.896 磺胺类 甲氧苄氨嘧啶 101.1 99.1 94.2 98.1 0.004 0.013 磺胺嘧啶 66.9 68.4 74.8 70.0 0.015 0.050 磺胺甲恶唑 114.0 104.6 108.6 109.0 0.029 0.095 磺胺二甲嘧啶 120.1 116.2 126.2 120.8 0.007 0.022 乙酰化磺胺甲恶唑 121.5 114.8 115.8 117.4 0.060 0.201 乙酰化磺胺甲嘧啶 119.0 108.7 133.0 120.2 0.020 0.065 取6个自来水样本分别在10、100和250 ng/L 3个加标水平进行加标回收试验，结果显示，方法的加标回收率为70.0 %～120.8 %，MDL为0.004～0.296 ng/L，MQL为0.013～0.988 ng/L。
2.6 实际样本分析
采用本研究建立的方法对浙江省某农村地区的70份居民家中自来水样本及7份空白样本进行27种抗生素检测，结果显示，共检出4种抗生素，皆为大环内酯类抗生素，分别为罗红霉素[（0.162～2.858）ng/L]、克拉霉素[（0.063～0.849）ng/L]、红霉素[（0.100～1.804）ng/L]和替米考星[（0.167～1.418）ng/L]；其余23种抗生素均未检出。作为质量控制样本，7份空白样本中均未检出目标抗生素。
3. 讨 论
本研究提出了一种经过方法验证的抗生素残留分析方法，用于分析自来水中五大类抗生素，包括25种母体化合物及2种代谢产物，涵盖了中国现阶段常见的人用抗生素、兽用抗生素和人兽共用抗生素。然而本研究未能纳入目前常用的 β – 内酰胺类抗生素（头孢他啶、头孢拉定、头孢克洛、阿莫西林、氯唑西林和青霉素等），主要因为其加标回收率并不理想，考虑可能与预处理过程中的酸碱环境和过高的温度条件有关。
在样本预处理过程中，选择合适的pH值来进行样本预处理可有效地避免某些抗生素的电离和降解，磺胺类化合物在酸性条件下更容易电离[11]，四环素类化合物在pH < 2时会极不稳定，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素和罗红霉素等大环内酯类化合物在碱性条件下更易维持分子形式[12]，因此本研究最终选择pH 7.5～8.5的酸碱环境进行样本预处理。同时，使用氘代同位素内标作为稀释剂参与水样本处理的全过程，可极大程度地追踪样品的浓缩富集净化过程，校正预处理流程中目标化合物的损失，有效降低干扰并提高准确度[10]。
相较于传统的手动固相萃取流程，全自动固相萃取方法对于大体积量水样本的富集具有较高的稳定性和重现性，极大程度降低了实验操作过程中的人为误差，提高检测结果的准确度。结合超高效液相色谱串联质谱的方法，在保证化合物分离良好的情况下，本研究在11.5 min内就完成27种抗生素的检测，缩短了化学分析时间，并提高了全流程的检测效率，为大样本量项目的检测与监测提供了便利。
自来水中抗生素残留多为痕量，较低的检出限是评估方法可靠性的重要参考因素，本方法验证结果通过样本加标回收率、浓缩倍数、IDL和IQL来校正，规范计算MDL和MQL，且数值低于同类型水中抗生素检测方法的研究[13-19]，为卫生应急检测及抗生素残留的环境研究提供了准确可靠的支撑。本研究选取浙江省某农村地区的自来水样本进行大批量实际样本的化学分析，其成功应用表明了本优化方法的可行性，作为农村地区的城镇管网末梢水，分析结果亦反映了当地的实际问题。该农村地区自来水样本中存在抗生素残留的情况，自来水样本中检出4种大环内酯类抗生素，但浓度含量水平均较低，与我国国内其他城市的生活用水中抗生素残留的研究结果相似[4，7，20-21]。其中该农村地区自来水样本中残留的罗红霉素、克拉霉素和红霉素可能与当地基层的处方用药习惯有关，替米考星是一种常见的兽用抗生素，广泛应用于畜禽养殖业，提示应加强对农村地区养殖业中抗生素使用的关注。此外，提升该地区自来水处理厂对大环内酯类抗生素的处理工艺技术亦可为居民提供更为安全放心的用水环境。
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表 1 27种抗生素药物及其6种内标物质的质谱参数
化合物名称 保留时间（min） 母离子 定量子离子 定性子离子 去簇电压（V） 碰撞电压（定量/定性，V） 环丙沙星 4.97 332.1 288.1 245.1 80 25/33 氧氟沙星 4.89 362.2 318.1 261.1 80 26/38 诺氟沙星 4.91 320.1 276.1 233.1 80 26/35 培氟沙星 4.95 334.1 316.1 290.2 80 27/25 恩诺沙星 5.10 360.1 316.1 245.1 80 28/36 达氟沙星 5.04 358.1 340.1 314.1 77 30/24 双氟沙星 5.35 400.1 356.1 299.1 80 28/41 洛美沙星 5.07 352.0 265.0 308.1 80 33/28 氟苯尼考 6.11 356.0 219.2 119.0 – 70 – 16/– 23 氯霉素 6.41 321.0 152.1 256.9 – 75 – 24/– 17 甲砜霉素 5.31 353.9 289.9 184.9 – 75 – 18/– 28 强力霉素 5.87 445.0 428.1 154.1 80 24/38 四环素 5.09 445.1 410.2 427.1 80 24/29 金霉素 5.66 479.1 462.0 444.0 80 24/28 土霉素 4.90 461.2 426.2 443.2 80 25/17 阿奇霉素 5.32 749.6 591.5 158.0 100 29/34 罗红霉素 6.85 837.6 679.5 158.1 50 30/37 克拉霉素 6.82 748.6 590.4 158.0 100 27/33 脱水红霉素 6.31 734.5 576.4 158.0 30 26/36 替米考星 5.63 869.5 696.5 174.2 100 52/52 螺旋霉素 5.22 843.5 142.1 174.2 60 45/50 甲氧苄氨嘧啶 4.75 291.1 230.1 123.1 95 33/34 磺胺嘧啶 4.64 251.1 156.0 92.0 40 22/38 磺胺甲恶唑 6.03 254.1 156.0 108.0 65 22/36 磺胺二甲嘧啶 5.36 279.1 186.1 156.0 60 23/27 乙酰化磺胺甲嘧啶 5.39 321.1 134.0 186.0 50 35/25 乙酰化磺胺甲恶唑 6.20 296.0 198.0 134.0 70 24/32 阿奇霉素 – D3 5.30 752.4 594.5 158.0 100 38/44 磺胺甲恶唑 – D4 6.01 258.1 160.0 112.0 65 22/36 氯霉素 – D5 6.39 326.0 157.0 262.0 – 75 – 23/– 16 四环素 – D6 5.08 451.2 416.2 433.3 80 26/18 罗红霉素 – D7 6.83 844.5 686.4 158.2 50 30/37 环丙沙星 – D8 4.95 340.0 296.0 249.0 80 24/33 
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表 2 27种抗生素药物的线性参数及仪器性能参数
类别 名称 线性方程 r 值 IDL（µg/L） IQL（µg/L） 日内精密度（%） 日间精密度（%） 氟喹诺酮类 环丙沙星 y = 1.99762x + 0.00030 0.9994 0.0344 0.1147 1.36 1.64 氧氟沙星 y = 11.55295x – 0.01254 0.9997 0.0057 0.0191 1.43 1.83 诺氟沙星 y = 1.71629x + 0.00866 0.9993 0.0364 0.1213 1.98 1.79 培氟沙星 y = 9.11526x – 0.05177 0.9994 0.0417 0.1392 1.75 3.60 恩诺沙星 y = 7.11977x + 0.04373 0.9991 0.0074 0.0246 1.65 1.79 达氟沙星 y = 15.90120x – 0.12187 0.9995 0.0196 0.0652 1.84 2.81 双氟沙星 y = 6.39833x – 0.01570 0.9997 0.0178 0.0592 2.64 3.69 洛美沙星 y = 6.64743x + 0.03654 0.9992 0.0095 0.0318 2.36 2.67 酚类 氯霉素 y = 1.17566x + 0.00355 1.0000 0.0141 0.0470 3.53 3.21 甲砜霉素 y = 0.61883x + 0.01184 0.9991 0.0256 0.0854 2.96 3.14 氟苯尼考 y = 0.16734x + 0.00389 0.9993 0.0341 0.1137 3.16 3.65 四环素类 四环素 y = 0.84604x + 0.00306 0.9992 0.0587 0.1958 1.28 1.35 土霉素 y = 0.98315x – 0.00257 0.9997 0.0640 0.2134 1.02 3.04 金霉素 y = 0.33857x + 0.00400 0.9973 0.0830 0.2767 1.29 1.76 强力霉素 y = 1.57520x + 0.00748 0.9995 0.0378 0.1259 1.54 1.72 大环内酯类 阿奇霉素 y = 0.48366x + 0.00832 1.0000 0.0294 0.0979 1.57 1.99 罗红霉素 y = 1.39340x + 0.02052 0.9995 0.0037 0.0124 2.30 1.89 克拉霉素 y = 1.31656x + 0.02119 0.9996 0.0026 0.0085 3.06 2.46 红霉素 y = 1.59802x + 0.03415 0.9990 0.0058 0.0192 1.65 2.16 替米考星 y = 0.51372x + 0.00475 0.9995 0.0114 0.0380 3.13 2.93 螺旋霉素 y = 0.01871x + 0.00008 0.9993 0.0829 0.2763 3.95 6.63 磺胺类 甲氧苄氨嘧啶 y = 5.58975x + 0.12082 0.9963 0.0015 0.0049 3.44 2.98 磺胺嘧啶 y = 1.56764x + 0.01207 0.9998 0.0042 0.0140 2.34 2.08 磺胺甲恶唑 y = 1.35660x + 0.00257 1.0000 0.0125 0.0415 1.98 2.00 磺胺二甲嘧啶 y = 3.23837x + 0.04558 0.9993 0.0032 0.0108 3.03 3.53 乙酰化磺胺甲恶唑 y = 0.72177x – 0.00201 0.9999 0.0283 0.0943 2.88 2.39 乙酰化磺胺甲嘧啶 y = 0.77589x – 0.00262 0.9999 0.0095 0.0315 3.26 2.95
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表 3 方法回收率及MDL和MQL
类别 化合物 加标回收率（%） MDL（ng/L） MQL（ng/L） 低浓度 中浓度 高浓度 平均值 氟喹诺酮类 环丙沙星 88.7 88.5 103.1 93.4 0.092 0.307 氧氟沙星 73.5 72.8 73.5 73.3 0.020 0.065 诺氟沙星 103.8 96.9 111.1 103.9 0.088 0.292 培氟沙星 87.0 96.2 97.4 93.5 0.112 0.372 恩诺沙星 86.1 104.9 108.3 99.8 0.019 0.062 达氟沙星 85.8 90.5 90.9 89.1 0.055 0.183 双氟沙星 83.6 96.3 99.5 93.1 0.048 0.159 洛美沙星 111.8 105.5 106.6 108.0 0.022 0.074 酚类 氯霉素 101.1 89.5 87.6 92.7 0.038 0.127 甲砜霉素 117.0 107.3 126.3 116.9 0.055 0.183 氟苯尼考 118.2 101.8 101.8 107.2 0.080 0.265 四环素类 四环素 77.6 84.9 88.8 83.8 0.175 0.584 土霉素 93.6 114.3 135.8 114.6 0.140 0.465 金霉素 89.6 65.2 55.2 70.0 0.296 0.988 强力霉素 84.9 63.2 64.8 70.9 0.133 0.444 大环内酯类 阿奇霉素 87.3 95.0 109.9 97.4 0.075 0.251 罗红霉素 86.3 102.1 107.7 98.7 0.009 0.031 克拉霉素 115.0 129.1 103.9 116.0 0.006 0.018 红霉素-水 79.6 101.1 115.9 98.9 0.015 0.049 替米考星 73.8 97.1 98.0 89.6 0.032 0.106 螺旋霉素 101.6 65.2 64.4 77.1 0.269 0.896 磺胺类 甲氧苄氨嘧啶 101.1 99.1 94.2 98.1 0.004 0.013 磺胺嘧啶 66.9 68.4 74.8 70.0 0.015 0.050 磺胺甲恶唑 114.0 104.6 108.6 109.0 0.029 0.095 磺胺二甲嘧啶 120.1 116.2 126.2 120.8 0.007 0.022 乙酰化磺胺甲恶唑 121.5 114.8 115.8 117.4 0.060 0.201 乙酰化磺胺甲嘧啶 119.0 108.7 133.0 120.2 0.020 0.065
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